MALDI-TOF在恶性肿瘤诊断中的运用介绍

　　恶性肿瘤（癌症）代表了一组异质性疾病，以生长速度快、易侵袭、易扩散和致死率高为特点，构成全球人类疾病的主要死亡原因。由于恶性肿瘤常常缺乏早期的特异性临床表现，大多数患者被诊断时已为晚期，治疗选择有限且预后不佳。早期诊断和早期监测到复发是提高患者生存率的最佳选择。因此，开发用于发现和快速检测特定生物标志物的非侵入性或微创方法成为至关重要的需求。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time Of Flight, MALDI-TOF）?技术，它将样品离子化成带电分子，并通过测量它们的质荷比（m/z）和/或结合其他技术判断恶性肿瘤成为研究热点。本文论述了MALDI-TOF技术诊断多种恶性肿瘤的研究进展和临床应用价值。

　　1. 肺癌（Lung Cancer，LC）：针对世界癌症之首的LC， 军科院与质谱中心早在2000年进行蛋白质组研究中建立及应用肽质量指纹谱鉴定方法，在二维电泳（Two—Dimensionalgel Electrophoresis，2-DE） 的基础上通过MALDI-TOF测量生成肽的质量鉴定出人LC细胞中的三个蛋白质，包括G3P2_HUMAN、UBL1_HUMAN 和 TPIS_HUMAN，鉴定为甘油醛-3-磷酸脱氢酶、遍在蛋白羧基末端水解同工酶和丙糖磷酸异构酶，具有灵敏度高、操作简单、分析速度快的特点。对于占LC绝对优势的非小细胞肺癌 (Non-Small Cell Lung Cancer，NSCLC)早期诊治可明显提高生存率。MALDI-TOF结合磁珠 (MB) 的纯化技术建立三种模型，血清蛋白指纹图谱采用纳米液相色谱-电喷雾串联质谱进一步鉴定差异肽，为NSCLC找到了潜在的血清生物标志物。筛查出的5个差异峰，NSCLC病例均明显升高，而术后恢复者逐渐下降到健康水平的趋势。其中与质谱峰 m/z 2953.73 相匹配的蛋白质被鉴定为纤维蛋白原α链，可能是NSCLC的辅助诊断指标。由于肿瘤异质性和大量突变位点的特性，MALDI-TOF 直接进行NSCLC中靶向突变的多重基因分型，预测突变的存在与百分比决策准确的诊断和治疗。对研究设计的NSCLC常见的158个突变位点，MALDI-TOF在NSCLC患者标本中能检测到最常见的不同频率的突变，并与文献数据相当；进一步用特异性核酸检测试剂盒验证其准确性较高。以上研究均证明用于肺癌的常规预测，MALDI-TOF是一种有效的方法，具有样本用量少、灵敏、可靠、快速、低成本的优点，是一种无创性并有成本效益的策略选择。

　　2.肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）：最早报道MALDI-TOF用于诊断HCC始于21世纪，新加坡学者Seow等针对非洲、东南亚和中国最常见的HCC，通过MALDI-TOF分析人HCC细胞系（ HCC-M）的蛋白质，鉴定出包括管家蛋白乙醇脱氢酶、α-烯醇化酶、天冬酰胺合成酶、异柠檬酸脱氢酶和 6-磷酸葡萄糖 1-脱氢酶等蛋白质；还鉴定了具有被假定与致癌过程相关的表达模式的蛋白质，包括 14-3-3 蛋白、膜联蛋白、抑制素和硫氧还蛋白过氧化物酶，初步建立其HCC蛋白质数据库。同一团队，MALDI-TOF分析2-DE凝胶上切下的HCC独特蛋白位点，产生了良好的质谱图，进一步胰蛋白酶肽序列分析，用NCBI的BLAST工具比对，在蛋白质和核苷酸数据库中搜索同源物，确定磷酸酪氨酰磷酸酶激活剂（PTPA）、RNA结合蛋白调节亚基、复制蛋白A 32 kDa亚基（RP-A）和N-乙酰神经氨酸磷酸合酶为HCC相关蛋白；提示MALDI-TOF是高通量蛋白质鉴定HCC的首选技术。韩国的学者通过差异表达蛋白进一步开发和改进用于诊断HCC的分子标记，扩展了目前可用的人体肝组织图谱。在2-DE 图标记基础上，用MALDI-TOF鉴定肽质量指纹图谱，找到肝脏肿瘤组织显著改变的丰度，最后鉴定出肿瘤组织中（与非肿瘤区域相比）1 个过度表达或15 个表达不足的蛋白质，可能成为诊断或靶点治疗的有用标志物；同时提出HCC患者中脂质代谢的两种酶在肿瘤组织中被下调，是综合研究需要考虑的问题。方法学的优化，可以降低成本并缩短周转时间。一种通过MALDI-TOF鉴定总血清蛋白指纹图谱的简单低成本技术被开发。首先血清样品简单地用蒸馏水稀释，随后点样到 MALDI 板上，无需事先进行色谱纯化或分离。MALDI Biotyper 3 软件自动生成了HCC患者及健康对照综合主谱图 (MSP)，使其完全分离开来，体现出显著的统计学差异。

　　3.胰腺癌（Pancreatic Cancer, PaCa）：推荐用于PaCa诊断的唯一肿瘤标志物CA 199，其敏感性和特异性有限，而且早期通常不会升高。临床急需PaCa诊断的血清生物标记物，MALDI-TOF与其他技术及信息学结合为早期识别PaCa提供了选择。李沛等应用MALDI-TOF技术与基于磁珠的弱阳离子交换色谱 (MB-WCX) 相结合， 鉴定PaCa患者的血清蛋白质和潜在生物标志物。ClinProTools 软件选择了几个标记来区分PaCa术前/术后患者和健康对照者的指纹图谱峰值，结果在三组中发现了49 个 m/z 独特峰，其中检测到33个峰有显著差别（P < 0.001）。两种蛋白质可以区分术前PaCa患者和健康对照，15种蛋白质可能是评估PaCa切除术成功的潜在生物标志物。证明MB-MALDI-TOF检测PaCa生成的血清肽组图谱，可用于诊断和判断预后。意大利学者则首先使用 Sep-Pak C18 纯化血清，再MALDI-TOF/MS Anchorchip技术进行分析，确定2 个特征峰（m/z 2049 和 2305）与PaCa相关，组合肿瘤标志物CA 199和指纹1550m/z与2937 m/z特征峰，诊断PaCa实现了AUC 0.970 的高值。MALDI-TOF分析显示1550m/z 特征是 Apo-A1 的一个片段，被确定为完整蛋白质并证明与 PaCa 密切相关，MALDI-TOF/鉴定的血清肽对PaCa既可以诊断又可以预测发病机制，为 PaCa 的早期精准治疗提供依据。基于MALDI-TOF的血清肽组分析结合生物信息学策略进行数据评估，将匹配的候选肽在基于特异性抗体的免疫亲和层析后通过 MALDI-TOF验证，并进一步 ELISA 测定法独立确认。结果两个主峰（m/z 3884；5959）实现了诊断PaCa达到86.3% 的灵敏度和97.6%的特异性。如果将峰值 m/z 3884 添加到常规PaCa肿瘤标志物CA 199中可明显提高PaCa诊断的灵敏度和特异性，达到AUROC（组合）为1.00。基于质谱的 m/z 3884 峰鉴定和随后的免疫定量显示血小板因子 4 为相应的肽，可作为诊断PaCa新的鉴别标记物，也可能成为PaCa和胰腺炎的鉴别诊断指标。

　　4.乳腺癌（Breast Cancer，BC）：BC是最常见的癌症类型，死亡率与地区发达程度显著相关，即BC在经济欠发达地区死亡率较高，提示早期筛查与诊断的重要性。MALDI-TOF通过筛查其蛋白质离子的特异峰诊断BC。Pietrowska, M等探讨识别早期BC患者特异的血清蛋白质组模式，在去除白蛋白和其他高分子量血清蛋白后，得到纯化的血清标本，筛选早期BC患者的三个特征峰，即蛋白质离子的 m/z 值大约为 2303Da、2866Da 和 3579 Da，由这三个成分构建的生物标志物诊断BC显示出88%的灵敏度和78%的特异性；同时，癌症患者组血液中骨桥蛋白水平显著 (p = 0.0003) 升高，证明MALDI-TOF诊断早期BC优于通过免疫测定在血液中分析的可用蛋白质生物标志物。我国的杨娟等作者基于磁珠的分离，用MALDI-TOF与ClinPro Tools软件相结合，对血清蛋白组学分析，筛选出高灵敏度和特异性的质谱峰，确定了78 个 m/z 峰，在BC、纤维腺瘤、健康人各组均存在差异，在BC组 1-6 个峰上调，7-10 个峰下调，其中的三个峰（2660.11m/z；1061.09m/z；1041.25m/z）随着术后恢复到健康值的趋势。MALDI-TOF诊断BC的血清多肽组谱，可用来识别诊断BC并判断预后的潜力工具。从BC发病机制看，脂质是癌细胞生长和增殖的必要条件，体现在细胞结构、信号通路和癌症进展中的重要作用。MALDI-TOF 通过鉴定出仅在活动性乳腺癌中的脂质种类和磷脂酰肌醇，不同进展期的溶血磷脂酰胆碱/磷脂酰胆碱的比值存在显著差异。显示MALDI-TOF 是探索BC相关的脂质特征和酶活性的有力工具，并可能建立新的疾病生物标志物。针对临床上高异质性、预后差和缺乏精确治疗靶点的三阴性BC (TNBC) ，即雌激素受体（ER）、人表皮生长因子受体2（HER2）和孕激素受体（PR）阴性，具有高扩散、快转移和易复发的特点。一种胶体耦合MALDI-TOF来定量游离血清氨基酸的方法被开发用以诊断TNBC，具有高灵敏度、高重现性和良好的定量性能。首先以金纳米粒子 (AuNPs) 形成油包水胶体并以脱蛋白血清封装，胶体干燥后的样品点靶，尺寸大小200-300 μm，AuNPs 单层致密，更利于小分子代谢物的 MALDI-TOF分析。结果发现，TNBC患者体内的游离氨基酸浓度明显低于健康对照组，且与乳房肿块患者的浓度也有显着差异，灵敏度、特异性和准确度分别达到 95%、100% 和 97%。该检测每次分析消耗的血清少于 1μL，仅需几分钟。具有成本低、样本消耗少、分析通量高、鉴定准确率高等优点，有望应用于TNBC的临床诊断。MALDI-TOF联合平台 IDsys RT分析血清N-聚糖，跟踪BC的分子特征并可预测BC复发的可行性。作者选择BC复发样本与非复发样本在多个时间点对 N-聚糖特征进行采样，通过 MALDI-TOF 进行连续监测，判断BC复发的曲线下最大面积为 0.91，体现N-聚糖分析在BC症的管理和监测方面显示出良好的潜力。

　　5.卵巢癌（Ovarian Cancer，OVC）：OVC是西方女性癌症的第四大常见死亡原因。超过70%的患者被诊断为晚期；5年生存率不足30%。由于OVC几乎没有特定症状，因此早期检测OVC以改善临床结果是一项挑战[1]。Shengjun Wu等将MALDI-TOF蛋白质组学指纹图谱技术与磁珠、蛋白质芯片读取器系统和生物信息学分析相结合，基于三种已识别的生物标志物（5486、6440 和 13720 Da），使用 Biomarker Patterns 软件构建了潜在癌症生物标志物的树状分析模型，从而有效地识别出OVC，敏感性和特异性分别为 90%和86.7%；并预测组合生物标志物的使用将进一步实现具有高灵敏度和特异性的强大而可靠的OVC诊断。而Jun Hwa Lee博士开发一种基于MALDI-TOF的OVC低质量离子判别方程 (LOME)，并评估三重离子的可能支持作用，质谱分析鉴定代谢生物标志物。最后筛选出具有鉴别力的低质量离子 (LMI) 对的峰强度比，包括137.1690 和 84.4119 m/z；496.5022 和 709.7642 m/z；以及 524.5614 和 709.7642 m/z三个 OVC LOME ;诊断OVC均达到 90% 以上的准确度。由于不同期与不同病理型别的OVC预后不同，埃及学者使用 MagSi-proteomics C8 珠、Ultraflextreme MALDI-TOF 和 ClinPro Tools 软件的组合找到特征蛋白质谱峰，发现21 个特征峰谱可区分健康与OVC患者，敏感性为 73%；而5 个特征峰可区分OVC与良性卵巢肿块患者，敏感性为 81%，特异性为 73.7%；20 个特征峰可区分疾病的早期和晚期阶段，识别准确率达 88.3%和交叉验证正确率达70%的效果。MALDI-TOF 蛋白质组学在诊断OVC的基础上，又可区分癌症的早期和晚期阶段及浆液型和非浆液型。在动物试验中已经验证认为MALDI-TOF 可作为一种独特的分析技术，以特定且灵敏的方式测量阴道微环境来诊断OVC。即使用鼠类浆液性OVC异种移植模型，直接检测动物小鼠阴道微环境样本。随着疾病进展，MALDI-TOF连续检测每周从小鼠身上获取的阴道灌洗液，分析显示质谱的4-20 kDa区域中的蛋白质产生的指纹并获得蛋白的完整m/z，值随着时间的推移，体现疾病进展的指纹特征，且这些指纹在所有模型小鼠中都基本稳定，在研究终点趋同。2020年，Li等系统评估MALDI-TOF对OVC的诊断性能，汇总18项研究，总体敏感性0.77（95% CI：0.73-0.80）；特异性0.72（95% CI：0.70-0.74），阳性似然比2.80（95% CI：2.41-3.24）；阴性似然比0.30 (95% CI: 0.22-0.40) 和诊断优势比 10.71 (95% CI: 7.81-14.68)；曲线下面积为 0.8336。体现MALDI-TOF具有良好的OVC诊断能力，当然，标准化程序还需要进一步优化。

　　6.膀胱癌（Bladder Cancer，BC）：BC症是西方国家第五位常见的癌症，全球每年新增35.6万例，浸润性是预后差和复发的评估依据，作者通过Bruker Ultraflextreme MALDI-TOF 进行内源性肽谱分析，选择生物标志物来检测BC并区分肌肉浸润性（T2+ 期）和非浸润性（Ta/T1 期）疾病，显示两组患者的尿液光谱存在显着差异，进一步结合白蛋白、总蛋白和血尿检测，T2+ 患者血尿比例更高，MALDI-TOF 数据的类别预测模型产生了高达 0.76 特征曲线下面积，侵袭性疾病显示相关的肽更丰富，与血尿有关，建议结合临床综合判断，提高BC诊断正确率。

　　7.结直肠癌（Coloretal Cancer，CRC）：CRC是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，男性第三位常见癌症和女性第二位常见的癌症，目前除了现有的粪便潜血试验、结肠镜和乙状结肠镜检查外，尚无广泛接受的体外诊断方法。MADLI-TOF诊断CRC被不断探索，并体现高效、准确的优势。首先，体细胞的突变是癌症的发生根本原因之一，MADLI-TOF 可以实现高通量检测基因突变平台，并检测到CRC相关的 299 个突变，确定了最常见的突变基因KRAS、TP53 和 APC，经新一代测序 (NGS) 验证了MADLI-TOF 多重测定的准确度。首都医科大学科研团队通过弱阳离子交换磁珠分离肽，并通过MALDI-TOF分析，将5种肽质谱峰（m / z 1895.3、2020.9、2080.7、2656.8和3238.5处的峰）鉴定为CRC的候选生物标志物。进一步验证诊断准确度为91.8％，灵敏度为95.6％，特异性为87.9％。在m / z 1895.3、2020.9和3238.5处的肽峰分别被鉴定为补体成分4（C4），补体成分3（C3）和纤维蛋白原α链（FGA）的部分序列。进一步深入分析组合多肽质谱，可以超越异质性，达到更高的特异性和灵敏度。而作者Liu等使用弱阳离子交换磁珠和 PBSII-C 蛋白质芯片读取器 ，结合Biomarker Wizard系统分析所有血清样品的蛋白质指纹，并鉴定出四种具有不同表达谱的潜在生物标志物，其相对分子量分别为 2870.7 Da、3084 Da、9180.5 Da 和 13748.8 Da，CRC患者前两种蛋白质下调，而后两种蛋白质上调，诊断敏感性和特异性分别为 92.85%和91.25%。MALDI-TOF和微芯片电泳组合，也可通过糖组学程序来诊断CRC，强调岩藻糖基化的作用及其在识别特定癌症中的新作用。MALDI-MS 揭示了几种岩藻糖基化的三触角和四触角聚糖在CRC样品中的丰度水平显着升高，并与对照组呈现显著差异。也提出由于糖基化复杂性，需要多方法和互补的分析工作流程来更准确地诊断早期CRC。

　　8.前列腺癌（ Prostate Cancer，PCa）：前列腺组织样本由于高度异质性，增加了PCa诊断难度。挪威的Andersen等使用MALDI-TOF和串联 MS 结合获得促进异质组织切片分子成像的方法诊断PCa进行初步探讨。首先MALDI-TOF获得了不同前列腺组织的代谢和脂质组学质谱，应用组织样本的正离子和负离子模式，以串联 MS 进行质量鉴定。前列腺功能相关的代谢物（包括柠檬酸盐、天冬氨酸、锌和精胺）在PCa中水平较低；能量代谢物（例如 ADP、ATP 和葡萄糖）水平更高，抗氧化剂牛磺酸水平更高，成为PCa诊断和预后的生物标志物。MALDI-TOF直接分析尿液样本中的脂质来鉴别PCa更易被临床接受。通过对比两种不同的基质提取脂质的方法，即α-氰基-4-羟基肉桂酸 (HCCA) 和 2,5-二羟基苯甲酸 (DHB)提取法，纯化和鉴定人类的特定脂质，鉴定尿样中的溶血磷脂酰胆碱、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇和三酰基甘油，发现与使用 HCCA 基质的方法对于使用 MALDI-TOF的脂质组学鉴定最有效，应用DHB则通过避免基质团簇的形成来实现有效电离。使用脂质质谱信号可以实现 83.3%到100.0%的诊断准确度，能够有效区分PCa患者和健康个体。使用特定纳米材料进行预处理可以简化质谱，信号更简单，指纹图谱特征更清晰。亲水性色谱纳米粒子 (HICNPs) 可以检测样本富集血清中的蛋白质和肽。经样本的主成分分析和偏最小二乘判别分析表明，PCa和对照之间的 MALDI-TOF 信号存在显着差异，分析准确度达 77%，且成本低、通量高，适于大规模评估。

　　9.骨肉瘤（Osteosarcoma，OS）：OS是最常见的骨原发性恶性肿瘤，也是儿童和青少年中第三大最常见的癌症。MALDI-TOF 结合2D DIGE技术，对肿瘤组织鉴定出22种差异表达的蛋白，包括8种上调蛋白和14种下调蛋白，进一步通过蛋白质印迹法验证了具有肿瘤更高比率的表达水平，发现结构和信号转导蛋白改变比例很大，并首先报道了一些涉及翻译和转录的低丰度蛋白质，例如EEF2（延伸因子2），LUM Lumican 23 kDa蛋白和GTF2A2（转录起始因子Iiaγ链），提示这些差异蛋白可能是诊断OS的潜在生物标志物，也初步阐述了骨肉瘤发生的分子机制。

　　10.鳞状细胞癌（Squamous Cell Carcinoma，SCC）：SCC是口腔最常见的恶性肿瘤，MALDI-TOF 质谱法对口腔颊粘膜刷取样本来进行完整细胞肽组分析 (ICPP)来判断SCC，进一步通过分析光谱模式，SCC患者与健康人和口腔其他病变有效区分，敏感性达到100%，特异性为 93%，总体准确性为 96.5%。MALDI-TOF技术使SCC的早期诊断准确、快速而简便。

　　MALDI-TOF通过检测特异性的多蛋白质/多肽谱（指纹）、新的血清生物标志物、或通过结合磁珠技术、分析软件来筛选质谱峰、基因、完整细胞肽分析等多种方式来确定不同部位的恶性肿瘤，反映蛋白质组的整体特征，已经在多项癌症诊断研究中体现其临床适用性，且具有非侵入、简单、快速的特点，很具开发潜力，结合恶性肿瘤部位及临床特征，可提高恶性肿瘤的早期诊断正确率，提升患者的存活率。